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掌握SDS-PAGE电泳的关键细节：从精确配胶（12%-15%分离胶）、样品变性处理（5-10分钟煮沸），到电压控制（浓缩胶80-100V，分离胶120-150V）和染色技巧，每一步都决定蛋白质分离的成败。冰浴电泳和新鲜缓冲液能避免条带异常，20-50μg/孔上样量是考马斯亮蓝染色的黄金标准。
蛋白质 SDS-PAGE 电泳 是实验室常用的蛋白质分离技术，其成功与否受多种因素影响。以下是关键注意事项，涵盖 制胶、上样、电泳、染色 等步骤：
一、制胶阶段
1、凝胶配制
（1）丙烯酰胺/双丙烯酰胺比例
分离胶通常为 12%–15%（根据蛋白质分子量调整），浓缩胶为 5%。
比例错误会导致凝胶孔径不适，影响分离效果（如小分子蛋白需高浓度胶）。
（2）TEMED 和 APS（催化剂）
现配现用，避免聚合失败（TEMED易挥发，APS易氧化）。
聚合过快（气泡多）或过慢（凝胶不均）需调整用量。
2、灌胶操作
（1）避免气泡：倾斜灌胶，或用异丙醇/水压平胶面。
（2）充分凝固：分离胶凝固（约30分钟）后再灌浓缩胶，否则会导致界面模糊。
二、样品处理
1、蛋白变性
（1）煮沸时间：95–100℃ 加热 5–10分钟，确保蛋白质变性（过长可能降解）。
（2）还原剂（DTT/β-巯基乙醇）：需足量（如5% β-巯基乙醇）以打断二硫键。
2、上样量控制
（1）常规考马斯亮蓝染色：20–50 μg/孔。
（2）银染/Western Blot：1–10 μg/孔（避免超载导致条带拖尾）。
（3）Marker选择：使用预染或非预染Marker，匹配目标蛋白大小范围。
三、电泳过程
1、缓冲液系统
（1）Tris-甘氨酸缓冲液（pH 8.3）需新鲜配制，避免pH变化影响迁移率。
（2）电泳槽缓冲液液面：需覆盖电极，但避免过多导致溢出。
2、电泳参数
（1）电压设置：
浓缩胶：80–100 V（低电压使样品压缩成窄带）。
分离胶：120–150 V（提高分辨率）。
（2）温度控制：高温会导致条带弯曲或凝胶变形，建议冰浴或低温电泳（尤其长时间运行）。
3、常见问题
（1）条带倾斜/微笑：凝胶不均匀或电极接触不良，检查缓冲液液面是否平衡。
（2）条带模糊：样品未溶解或存在杂质，离心后上样。
四、染色与脱色
1、 考马斯亮蓝染色
（1）固定液（40%甲醇+10%乙酸）浸泡30分钟，去除SDS。
（2）染色时间：1小时（过久易背景深）。
（3）脱色：10%乙酸+20%甲醇脱色至背景清晰。
2、银染
（1）高灵敏度，但需严格控制步骤（如甲醛还原时间）。
（2）避免污染（手套操作），否则会出现黑点。
掌握这些关键点可显著提高 SDS-PAGE 的重复性和分辨率。若用于后续 Western Blot，需注意转膜前的凝胶平衡（避免甲醇过度收缩凝胶）
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